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液相色谱小知识
发布时间:2010-10-21   点击次数:13081次

一.做HPLC分析时,柱压不稳定,原因何在?如何解决?
原因可能有:
1泵内有空气,解决的办法是清除泵内空气,对溶剂进行脱气处理
2比例阀失效,更换比例阀即可。
3泵密封垫损坏,更换密封垫即可。
4溶剂中的气泡,解决的办法是对溶剂脱气,必要时改变脱气方法
5系统检漏,找出漏点,密封即可。
6梯度洗脱,这时压力波动是正常的。
二.请问HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法"
1样品量不足:解决办法为增加样品量
2样品未从柱子中流出:可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3样品与检测器不匹配:根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4检测器衰减太多:调整衰减即可。
5检测器时间常数太大:解决办法为降低时间参数
6检测器池窗污染:解决办法为清洗池窗。
7检测池中有气泡:解决办法为排气。
8记录仪测压范围不当:调整电压范围即可。
9流动相流量不合适:调整流速即可。
10检测器与记录仪超出校正曲线:解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线。
三.液相色谱仪色谱柱使用及维护
每天用足够的时间来平衡色谱柱,您就会在处理问题方面获得zui大的"补偿",而且您的色谱柱的寿命也会变得更长!------ 一定得做!
  新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试,即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且,在以后的使用中,应时常对色谱柱进行测试。
  卡套柱的安装(不加预柱)
1.将卡套架套入柱芯
2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使柱芯高于夹套(见下图)
3.将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片
4.将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧
5.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端
6.连接到液相色谱仪,PEEK接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用扳手
注意:使用卡套柱时,两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗,任何时候都不能将卡套取下来,否则会造成填料的流失。
卡套柱的安装(加预柱)
1.将卡套架套入柱芯
2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使夹套高于柱芯(见下图)
3.将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片
4.将"子弹头"预柱放入卡套片内
5.将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧
6.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端
  平衡色谱柱  反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉,因此在用流动相分析样品之前,应使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱;如果您所使用的流动相中含有缓冲盐,应注意用纯水"过渡"。
  硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相,请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡
  如何平衡色谱柱?
  平衡过程中,将流速缓慢地提高
  用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂度如果较低,则需要较长的时间来平衡)
  色谱柱的再生   进行色谱柱再生时,应使用一个谦价的泵,我们建议不使用您的液相色谱仪上的泵。
   表1 建议用来冲洗的溶剂体积
   注意:
   在对NH2改性的色谱柱进行再生时,由于NH2可能成铵根离子的形式存在,因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗,然后再用水冲洗至碱溶液*流出。
   **如果简单的有机溶剂/水的处理不能够*洗去硅胶表面吸附的杂质,用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
   色谱柱的维护
   1.使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)
   2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围
   3.避免流动相组成及极性的剧烈变化
   4.流动相使用前必须经脱气和过滤处理
   5.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕柱子冲洗干净,并保存大乙腈中
   6.压力升高是需要更换预柱的信号
每天用足够的时间来平衡色谱柱,您就会在处理问题方面获得zui大的"补偿",而且您的色谱柱的寿命也会变得更长!------ 一定得做!
  新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试,即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且,在以后的使用中,应时常对色谱柱进行测试。
  卡套柱的安装(不加预柱)
1.将卡套架套入柱芯
2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使柱芯高于夹套(见下图)
3.将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片
4.将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧
5.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端
6.连接到液相色谱仪,PEEK接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用扳手
注意:使用卡套柱时,两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗,任何时候都不能将卡套取下来,否则会造成填料的流失。
卡套柱的安装(加预柱)
1.将卡套架套入柱芯
2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使夹套高于柱芯(见下图)
3.将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片
4.将"子弹头"预柱放入卡套片内
5.将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧
6.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端
  平衡色谱柱  反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉,因此在用流动相分析样品之前,应使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱;如果您所使用的流动相中含有缓冲盐,应注意用纯水"过渡"。
  硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相,请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡
  如何平衡色谱柱?
  平衡过程中,将流速缓慢地提高
  用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂度如果较低,则需要较长的时间来平衡)
  色谱柱的再生   进行色谱柱再生时,应使用一个谦价的泵,我们建议不使用您的液相色谱仪上的泵。
   表1 建议用来冲洗的溶剂体积
   注意:
   在对NH2改性的色谱柱进行再生时,由于NH2可能成铵根离子的形式存在,因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗,然后再用水冲洗至碱溶液*流出。
   **如果简单的有机溶剂/水的处理不能够*洗去硅胶表面吸附的杂质,用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
   色谱柱的维护
   1.使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)
   2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围
   3.避免流动相组成及极性的剧烈变化
   4.流动相使用前必须经脱气和过滤处理
   5.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕柱子冲洗干净,并保存大乙腈中
   6.压力升高是需要更换预柱的信号
四.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移,有时发生快速变化,原因何在?如何解决?
关于漂移问题:
1温度控制不好,解决方法是采用恒温装置,保持柱温恒定
2流动相发生变化,解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等
3柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡
关于快速变化问题
1流速发生变化,解决办法是重新设定流速,使之保持稳定
2泵中有气泡,可通过排气等操作将气泡赶出。
3流动相不合适,解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合
五.C18柱出什么问题了?买了一根 Kromasil 100-5C18柱,刚开始用时效果较好,条件为30mM KH 2 PO 4 ,pH=2.00,柱温30度。连续使用大约两天后,各标准品峰明显前移。有些原来能分开的峰,现在用同样的条件已经分不开了。zui近我继续使用该柱,不同的是每天连续使用时间不超过12小时。使用后先用5%甲醇/水冲洗,再用100%甲醇冲洗。这样使用了三天,峰的保留时间不再前移。因此,我有二个问题: A 峰的前移是由于C18被水解的缘故吗?如不是,又是什么原因呢? B 对于使用低pH纯水系缓冲盐的C18柱,每天使用12小时,用5%甲醇/水洗净缓冲盐,再用甲醇冲洗,能延长C18柱的使用寿命吗?
使用Kromasil 100-5C18出现这种情况是不了解这种柱子的特性。关于上面的二个问题,作如下分析:
1.峰前移的原因是使用了纯水流动相的缘故。kromasil填料以高碳覆盖量而自豪,在纯水(或水比例大于95%)的环境下因为C18官能团非极性排斥,会使伸展状态的官能团在排斥力的作用下“倒伏”,同时也因极性力形成的张力使“水膜”在填料微孔口形成而覆盖微孔口,这两点都使分析物难以与C18官能团接触,保留时间因此提前。情况下,甚至丧失保留性质。不仅是C18,对于Kromasil的其他填料,都反对用纯水(或水比例大于95%)的流动相。
2.其后提到“zui近我继续使用该柱,不同的是每天连续使用时间不超过12小时。使用后先用5%甲醇/水冲洗,再用100%甲醇冲洗。这样使用了三天,峰的保留时间不再前移。”,这正是采用了正确的方法。用甲醇或乙腈等纯溶剂冲洗较长时间,可以使“倒伏”的官能团回复其原有状态,之前用5%甲醇水溶液洗去盐再用纯甲醇是非常地道的做法!
3.一般不提倡你所提到的纯水使用环境。非要这样用,我也建议你用预柱,缩短这样的使用 时间,及时冲洗,隔夜封存于纯有机溶剂都是很好的柱维护措施。
另外可考虑是否可在流动相中添加 5%的甲醇或乙腈,如不影响分离情况和峰形的话。 其它类型的C18也有这种现象,只是没有Kromasil柱明显,为了克服纯水溶剂长时间运行产生“水性坍塌”对色谱柱分离造成的影响,现在有新型的色谱柱可以在100%水相中稳定。
六.走空白梯度,在 11-13min出现未知的异常峰,并且峰值还挺大,有机相从0%-100%,这是为什么?
一般走空白梯度是不进样的,大多数情况这些异常峰是流动相本身造成的。在等度洗脱的情况下,流动相的少量杂质一般不会影响基线和噪音,这些杂质要么不出来,要么不间断出来,不会产生异常峰(鬼峰)。对于梯度洗脱,水相或有机相中的强保留杂质在开始洗脱时,由于有机相的比例低,在柱子上保留而不洗脱,但当流动相中有机相比例不断加大,在色谱柱中吸附浓缩的杂质开始被洗脱,从而在某些位置出现异常峰(鬼峰)。还有,如果梯度设置不当,流动相比例变化太快,紫外波长较低时也容易出现异常峰。另外需要注意的是,如果梯度泵的比例阀有问题或流动相混合器效果不好或有少量的气泡存在,也会出现这种现象。因此,对于梯度洗脱,大多数原因在流动相,所以流动相的纯度非常关键,尤其是水的纯度以及添加的流动相改性剂的纯度。
七.我zui近更换了另一种牌号的ODS柱,虽然分离情况仍可以,但保留时间不能重现,为什么?
这是因为被分析物可能具有形成氢健的能力。尽管过去几年来,填料的制造技术有了极大的提高,但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此,同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物,如三乙基胺(TEA),将会使硅醇基的成键能力饱和,从而保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。
现 象 主要原因 措 施

A 输液不稳定 泵的脉流大
1。泵头内进入气泡。
●按pump ,驱出气泡。
●排液管连接口连接注射器抽出气泡。

2。泵头内存有以前的流动相。
●按 pump ,将旧流动相*清洗出去。

3.吸滤器的管内进入气泡。
●按 pump ,将旧流动相*清洗出去。
●震动吸滤器,驱出气泡。
●吸滤器网眼堵塞时,用超声滤清洗。超声滤清洗无效时,需更换。(检查吸滤器网眼堵塞的方法 取出过滤部分,记录压力波形。 如果取出后压力波形不正常,则吸滤器网眼堵塞。 )
●对流动相脱气。

4。单向阀工作不正常
●输送异丙醇,清洗单向阀。
●清洗无效时,用超声波清洗单向阀,或更换单向阀.

5.泵头与泵头座之间的缝隙,或清洗液出口漏液
●更换柱塞密封圈。
●更换柱塞密封圈后仍漏液时,更换柱塞。

6.流路的连接处漏液
●用力拧紧公螺母。
●拧紧后仍漏液时,更换公螺母和箍环。

7.流路堵塞,或将要堵塞。
管道过滤器用超声波清洗,或更换过滤器。
●找出堵塞的部件,更换新部件。

8。柱塞密封圈的使用寿命将到极限。
●更换柱塞。

B 流量比设定值小
1.单向阀工作不正常。
●输送异丙醇,清洗单向阀
●清洗后仍无效时,用超声波清洗单向阀,或更换单向阀。

2.吸滤器网眼堵塞。(*2)
●用超声波清洗吸滤器。超声波清
C 洗无效时,更换吸滤器。 保留时间的再现性不良
1.单向阀工作不正常。
●清洗仍无效时,更换单向阀,或用超声波清洗。

D 高压梯度时2台输液泵的压力表示不一致
(相差在±0.5MPa(5kSf/cm2)或±2%以内属于正常)
1.压力传感器的零点未对准。
●用辅助功能"ZER。 ADJ",调整零点

2。其中1台输液泵的管道过滤器网眼堵塞。
●用超声波清洗管道过滤器,或更换管道过滤器。

3。2台输液泵的流路合流之前,流路有堵塞的地方
●找出堵塞的部件,更换部件。

E 压力上不去
1.排液阀开着
●关闭排液阀。

2。流路连接处漏液
●拧紧公螺母。
●拧紧后仍无效时,更换公螺母和箍环。

F 压力上升过高(取下柱确认)
1.管道过滤器堵塞。
●管道过滤器用超声波清洗,或更换

2.流路堵塞。
●找出堵塞的部件,更换。

3.配管的内径过细
●使用的管子。
液相色谱柱的管理
摘 要:介绍了影响色谱柱使用寿命的几个因素,探讨了色谱柱规范化管理和保养的经验。
关键词:液相色谱;柱;管理;保养
液相色谱法是20世纪70年代急剧发展起来的一项、快速的分离、分析技术。液相色谱法是指流动相为液相的色谱技术,在经典的液相色谱法基础上,引入气相色谱法理论,在技术上采用高压泵、固定相和高灵敏度检测器,实现了分析速度快、分析效率高和操作自动化,它具有高压、高速、、高灵敏度等特点。它是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂,缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品,由流动相带入柱内,在柱内各成分被分离后依次进入检测器,色谱信号由记录仪、积分仪或色谱工作站记录。
色谱柱是液相色谱的心脏,在液相色谱仪的使用中,保持色谱柱的柱效、容量和渗透特性,延长柱子的使用寿命非常重要。色谱柱使用时间后就会出现柱压升高、柱效降低、峰形畸变和分离度降低、保留时间改变等变化,如不采取措施,将会缩短色谱柱的使用寿命,影响工作效率,并造成一定的经济损失。因此,有必要加强和规范色谱柱的管理,从而延长
色谱柱的使用寿命。本文从影响色谱柱使用寿命的几个因素出发,从管理的角度,探讨色谱柱的维护与保养。
1 色谱柱的类型
常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶、离子交换树脂、凝胶或玻璃微球等填充剂。在化学键合硅胶中以十六烷基硅烷键合硅胶zui常用,辛基硅烷键合硅胶次之,氰基或氨基键合硅胶也有使用。近年来,由于蛋白质等生物大分子物质分离提纯技术的飞速发展,离子交换色谱柱、凝胶色谱柱的应用也越来越广。
2 影响色谱柱使用寿命的因素
2.1 流动相
在以水溶液为流动相时,水溶液中的微生物例如细菌容易生长,当用水溶液或有机酸缓冲液保护柱子时,一些霉菌可能在色谱柱中滋生,堵塞固定相颗粒间的空隙。由于湿法填充技术的问世,目前普遍使用的色谱柱填料直径一般都小于10um,流动相中的颗粒杂质很容易先沉积在柱头然后慢慢堵塞柱子。流动相的pH值对色谱柱也有影响,特别是对化学键合硅胶填料,水溶液的pHzui适范围在2~7.5之间,当pH>8时,硅胶会释出生成絮状物堵塞柱子,且难以复原,柱效很快降低,甚至*失效。当在缓冲液中加入有机溶剂例如甲醇或乙腈时,盐类的溶解度下降,会析出盐沉淀,堵塞柱子。同时流动相中的有机溶剂和盐会腐蚀色谱柱头的筛板,产生柱头凹陷。流动相的极性对柱子也有一定影响,对于硅胶柱,甲醇、水、冰乙酸等极性较大物质会破坏填料,反之,对于化学键合硅胶,极性小的物质如正丁醇、二氯甲烷等也起同样的作用。碱性溶液会破坏阳离子交换树脂色谱柱,而酸性溶液容易损坏阴离子交换树脂柱。
2.2 样品和固定相
如果有少量或微量的样品不能够溶解在流动相中,在通过固定相会堵塞柱子。样品中的颗粒杂质也会堵塞柱子。样品组分例如糖、蛋白质等通过柱子时会产生不可逆吸附,这样固定相的活性点被覆盖。样品组分还会与固定相产生反应,尤其是对于氨基柱的影响较为严重,因为氨基易与酐、酮形成希夫(Schiff)缩合而减少活性点,使保留时间缩短。色谱柱键合相基团脱落、固定相分解和活性基团变性以及会影响柱效和保留时间的显著改变。大多数键合相都是通过硅氧硅键(Si-O-Si)连接在硅基质上,形成带有有机基团的固定相Si-O-Si-R(R为CnH2n+1),硅氧硅键可能在水溶液中水解而断裂,使键合基团脱落。
3 液相色谱柱的管理
3.1 色谱柱的管理
制定色谱柱管理的标准操作规程并严格执行。每一根新购进的色谱柱必须造册登记,内容包括:生产公司、品名、型号、规格、购进时间、启用时间、单价、柱内保护溶液等。色谱柱分类存放,硅胶柱、化学键合硅胶柱、氰基或氨基柱、离子交换树脂柱、凝胶柱各用一个色谱柱盒,盒上贴上标签,注明类别。随柱说明书装入密实袋附在登记本上。每启用一根色谱柱,在色谱柱上贴上标签,注明启用日期。每根柱子每两个月保养一次,特别是对于一些使用频率少的柱子,因为放置时间长,容易干柱,每一次做好保养记录。对于确已失效的柱子,做好停用记录,不能随意丢弃,专门存放,如果现用的柱子的填料需要填补,可以用存放的柱子的填料。在从事生产的单位的质检部门,对于使用时间较长柱效降低的柱子,可把它用于检测产品的中间体。
3.2 色谱柱的保养
色谱柱使用一段时间后,常遇到柱子被污染,柱效会有一定程度的下降,采用适当的方法对色谱柱进行保护,可以延长色谱柱的使用寿命。
样品和流动相的处理:溶解的样品进样前用滤膜过滤,以除去不溶物。如果必要,需进行样品的预处理。流动相中如有不纯物质将影响柱效,所以溶剂尽量使用色谱级别的,至少是分析纯级别,流动相使用前用微孔薄膜过滤。在流动相的输液管前安装过滤器。过滤器定期用甲醇超声清洗,如果效果不好,可用10%的稀硝酸浸泡清洗。对于堵塞严重的过滤器,可在火焰上灼烧后再清洗。
保护柱(预柱)的使用:对于较昂贵的色谱柱,可以在柱前加一保护柱,防止样品中杂质污染分析柱,对于制备柱,因其进样量大,使用保护柱尤为重要。
常规处理:硅胶、氧化铝、极性键合相色谱柱每一次用完后用低流速长时间的二氯甲烷或正己烷等溶剂冲洗;键合相硅胶色谱柱、离子交换色谱柱和凝胶色谱柱先用蒸馏水冲洗,再用甲醇冲洗,然后用甲醇与蒸馏水以一定比例混合的溶液冲洗后过夜。
对于已使用一段时间后柱效下降的色谱柱可按以下方法进行再生。再生处理包括活化(右→左)和净化(左→右)两种。硅胶、氧化铝、极性键合相色谱柱按下列顺序冲洗:*基戊烷或己烷←→三氯乙烷←→乙酸乙脂←→丙酮←→乙醇←→水。键合相硅胶柱:蒸馏水←→甲醇(冲洗过程中可加入少量二甲基甲酰胺)。离子交换树脂柱:高浓度的NaCl溶液(1-2molL的NaCl溶液)可使大部分树脂再生,油脂等少数与树脂紧密结合的物质可用低浓度碱溶液(如0.1molL的NaOH溶液)冲洗,酸性有机物吸附在固定相的用低pH缓冲液冲洗,碱性有机物用高pH缓冲液冲洗,然后再用蒸馏水←→甲醇←→二氯甲烷←→甲醇←→蒸馏水冲洗。凝胶色谱柱:由于凝胶色谱柱是根据被分离物质的分子量大小而分离物质,通常用稀的氢氧化钠或非离子型去垢剂(0.2%-1%NP-40或Lubrol)冲洗可除去大部分的结合物质,如果一些污染物仍然不能清除时,用24%或30%乙腈冲洗过夜可除去疏水蛋白,用30%-50%乙酸可除去亲水蛋白,用蛋白水解酶处理可分解凝胶中剩余的痕量胃蛋白酶,然后再用蒸馏水←→甲醇←→蒸馏水冲洗。
已污染的色谱柱的处理:因保留强的物质污染,流动相或样品中不溶物沉积于柱头,可用下列方法洗涤:去除脂类可用四氢呋喃、乙腈或甲醇洗涤;去除蛋白质可用乙腈、丙醇和1%三氯乙酸进行梯度洗脱;一些高疏水性化合物可用乙腈或甲醇洗脱,同时反复注入100-200ml的四氢呋喃。
柱头处理:对于柱头堵塞污染严重的情况而且用溶剂冲洗无效的色谱柱,只有打开柱子去除柱顶的填料重装:先拆下不锈钢烧结过滤器,检查柱床,常见凹陷或受污染的带色填料,剔去不规则床层和带色填料,使柱床显白色并*水平,再用甲醇作糊状填料匀浆液,将糊状填料匀浆液滴在柱上靠重力从匀浆液中排出甲醇液,重复直到填料水平。
柱子的贮存:首先柱子必须清洗干净后才能贮存,柱子不能贮存在水或水性溶剂中,否则会引起微生物的滋生。极性色谱柱可用适当溶剂如二氯甲烷冲洗;键合相色谱柱用甲醇冲洗;阴离子交换色谱柱用0.002%洗必泰(双氯苯双胍己烷)的缓冲液冲洗,阳离子交换色谱柱用0.005%硫柳汞缓冲液冲洗;凝胶色谱柱用缓冲液中加0.02%叠氮化钠或用20%乙醇冲洗。再将柱子两头密封,以防止溶剂蒸发使柱子干燥而引起柱子结构的几何学改变。
液相色谱柱的保护
王 新
摘 要:本文讨论流动相及样品对液相色谱柱的损害因素,探讨液相色谱柱的保护方法。
关键词:色谱柱;损害;液相色谱法
在液相色谱仪的使用中,保持液相色谱柱的柱效、容量和渗透特性,延长柱子的使用寿命非常重要。色谱柱用久后常出现柱压升高,柱效降低,峰形畸变,保留时间改变等变化,如不采取适当措施,色谱柱将无法再使用,缩短色谱柱的使用寿命,本文从影响色谱柱的外界因素出发,并考虑色谱柱固定相性质的变化,讨论流动相和样品对色谱柱造成损害的因素,探讨保护方法。
1 流动相对色谱柱的损害因素
颗粒杂质:目前广泛使用的柱填料直径多在10um以下,微小的颗粒杂质很容易使柱子发生堵塞,因此使用的溶剂应当过滤,柱子上端接头应当装微孔过滤片以阻挡颗粒物进入柱中。
水溶液中的微生物:以水溶液为流动相时,应防止细菌的生长,五氯酚、叠氮化钠、辛酸等能防止细菌生长。当用水溶液或有机酸缓冲液保护柱子时,一些厌氧霉菌可能在色谱柱中滋生,堵塞固定相颗粒间的空隙。
pH值:对硅胶基键合相填料,水溶液pH值不可超过2-7.5这一范围,当pH>8时,硅胶会释出
生成絮状物堵塞柱子,且难以复原,柱效很快降低,甚至*失效。
盐类析出:当在流动相缓冲液中加入和水混溶的有机溶剂时,其中的盐类溶解度下降,可析出盐类沉淀,堵塞柱子;加入粘度不同的样品溶液也可能发生类似现象。所以缓冲液中盐的浓度宜低,样品提取液的组成应和流动相匹配。
2 样品对色谱柱的损害因素
杂质堵塞:样品中的微粒同样会使柱子堵塞,样品也应进行过滤处理。
样品组分的不可逆吸附:通常被吸附的组分有蛋白质、醣等,可以采取加装保护柱,或使用适应的溶剂反冲来处理。常用溶剂有四氢呋喃(适用于溶解有机高聚物和工业样品中的焦油)、高浓度的脲或盐酸胍溶液(使蛋白质改性而洗脱)、高离子强度的磷酸盐缓冲液(pH=7,适合反相柱和离子交换柱,可除去蛋白质和醣等)。
样品组分与固定相反应:这种反应对NH2柱的影响较严重,NH2易和酐、酮形成希夫(Schiff)缩合而减少活性点,使保留时间缩短,因此羰基化合物样品和流动相(如丙酮、乙酸乙酯等)不宜使用NH2柱。
活性点被覆盖:由于固定相吸附样品中的组成或杂质而使活性点被覆盖,在柱压升高的同时保留时间减少,将样品过滤或使用萃取分离柱(对大分子有机物如蛋白质、白细胞等)效果较好。
3、色谱柱固定相的化学变化
色谱柱固定相分解、活性基团变性以及键合相基团脱落会使保留时间显著变化。
3.1 键合相基团脱落
绝大多数键合相都是通过硅氧硅键(Si-O-Si)连接在硅基质上,形成带有机基团的固定相Si-O-Si-R(R为G18H37、C8H17、CnH2n+1)。硅氧硅键可在水溶液中水解而断裂,使键合相基团脱落,对C2和NH2柱键合相基团脱落不可忽视。为减少或防止基团脱落,可增加流动相的有机溶剂量,降低离子强度和pH值,对基团已脱落的固定相,可用合适的硅烷试剂再生。
3.2 固定相分解或活性基团变性
例如氰基柱的保留时间显著缩短,但键合相中C、H、N的百分含量并无大变化,证明未发生—CN水解成-COOH反应,而是形成了衍生物。在硅上增加烷基可减少水解。
4、液相色谱柱的保养
色谱柱在使用一段时间后,常遇到柱子受污染,柱效下降的问题,采用适当的方法对色谱加以保护和再生,能够延长色谱柱的使用寿命。
使用保护柱和过滤样品、流动相:流动相中若有不纯物聚积存柱顶,将影响柱寿命,所以溶剂应使用HPLC级的,样品和流动相用前先以微孔薄膜过滤。对于较昂贵的色谱柱,可以在柱前加一个保护柱,防止样品中杂质污染分析柱,对于制备柱,因其进样量大,使用保护柱尤为重要。
已污染柱的处理:因保留强的物质污染,柱顶或样品中不溶物沉积于柱顶,可用下列方法洗涤1)去除脂类可用四氢呋喃乙腈或甲醇洗涤;(2)去除蛋白质可用乙腈,丙醇和1%三氯乙酸进行梯度洗脱;(3)某些高疏水性化合物,可用乙腈或甲醇洗脱,同时反复注入四氢呋喃(100-200)ml。
对于使用一段时间后柱效下降的色谱柱可按下列方法进行再生。再生处理包括活化(右→左)和净化(左→右)两种。(1)硅胶、氧化铝和极性(正相)键合相色谱柱按下列顺序依次冲冼:*基戍烷或已烷→三氯乙烷→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水。(2)键合相硅胶柱:苯基、氰基键合相柱按以下顺序冲洗:蒸馏水→甲醇(冲洗过程中可加入少量二甲基甲酰胺)→分离样品用的流动相。(3)阴、阳离子交换柱:酸性有机物吸附在固定相表面的用低pH缓冲液冲洗,碱性有机物用高pH缓冲液冲洗,然后依次用蒸馏水→甲醇→二氯甲烷→甲醇→蒸馏水冲洗干净。
柱头处理:对于柱顶堵塞、严重污染,用溶剂冲洗无效的色谱柱,只有打开柱子去掉柱顶的填料重填:先拆下不锈钢烧结过滤器,检查柱床,常见塌陷或受污染的带色填料,剔掉无规则床层和带色填料,使柱床显白色并*水平,再用甲醇作糊状填料匀浆液,将糊状填料匀浆液滴在柱上靠重力从匀浆液中排出甲醇液,重复直到填料水平。
柱子的贮存:柱子不能贮存于水或水性溶剂中,否则会引起细菌在柱中生长或产生盐类沉淀。贮存前应先用适当的溶剂(如甲醇),将柱子冲洗干净,再将柱子两头密封,以防溶剂蒸发使柱子干燥而引起柱子结构的几何学改变。
液相色谱柱的选择
一、硅胶基质填料
  1、正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica)以及其他具有极性官能团胺基团,如(NH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料。
  由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基团极性较强,因此,分离的次序是依据样品中各组分的极性大小,即极性较弱的组份zui先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如正已烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等。
  2、反向色谱 反向色谱用的填料常是以硅胶为基质,表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强,通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分zui先被冲洗出,而极性弱的组分会在色谱柱上有 强的保留。
  常用的反向填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
  二、聚合物填料 聚合物填料多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等,其重要优点是在PH值为1—14均可使用。相对于硅胶基质的C18填料, 类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效较低。
  三、其它无机填料 其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质,一般于特殊的用途。如,石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础,不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体,由于在HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的色谱柱柱床,其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强,应用范围受到一定限制,所以未能广泛应用。新型色谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱,应用PH1-14,温度可达100℃。由于氧化锆填料是zui近几年才开始研究,加之面临的实验难度,其重要用途与优势尚在进行之中。
  怎样选择填料粒度  ,商品化的色谱填料粒度从1um到超过30um均有销售,而目前分析分离主要用3和5um填料进行。填料的粒度主要影响填充柱的两 参数,即柱效和背压。粒度越小,柱压越大,柱压的增加限制了粒度小于3um的填料应用。在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度,但不是*的因素。如果固定相选择是正确,但是分离度不够,那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3um的色谱柱的背压却是5um的2倍。与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱,即相同的塔板数或分离能力,但是柱长更短,以缩短分析时间。另外,可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱的压力。
柱子的极性取决于固定相的极性
我们常用柱子的极性如下:
一、非极性
1、100%Dimethyl polysiloxane,100%聚二甲基硅氧烷,商品名:AC1,OV-101,OV-1,DB-1,SE-30,HP-1,RTX-1,BP-1
二、弱极性
2、5%Phenyl dimethyl polysiloxane, 5%二苯基(95%)二甲基聚硅氧烷,商品名:AC5,SE-52,
3、5% Phenyl 1%vinyl dimethyl polysiloxane,5%二苯基1%乙烯基(94%)二甲基聚硅氧烷,商品名:OV-5,DB-5,SE-54,HP-5,RTX-5,BP-5
注:2、3常无严格区分,通常混称。
三、中等极性
4、50%Phenyl dimethyl polysiloxane, 50%二苯基(50%)二甲基聚硅氧烷,商品名:OV-17,HP-50,RTX-50
5、14%Cyanopropyl phenyl polysiloxane, 14%氰丙基苯基(其中7%氰丙基7%苯基)(86%)二甲基聚硅氧烷,商品名:AC10,OV-1701,DB-1701,RTX-1701
6、50% Cyanopropyl phenyl polysiloxane,50%氰丙基苯基(其中25%氰丙基25%苯基)(50%)二甲基聚硅氧烷,商品名:AC225,OV-225,BP-225,DB-225,HP-225,RTX-225
四、强极性
7、polyethylene glycol,聚乙二醇,商品名:AC20,PEG20M,HP-INNOWAX(FFAP是其与2-硝基对苯二甲酸的反应产物)
使用范围 反相柱优点是固定相稳定,应用广泛,可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料,使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8,流动相的PH值小于2时,会导致键合相的水解;当PH值大于7时硅胶易溶解;经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况,色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时,建议选择PH范围大的柱子,例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。 2.填料的端基封尾(或称封口) 把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾,可改善对极性化合物的吸附或拖尾;含碳量增高了,有利于不易保留化合物的分离;填料稳定性好了,组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物,选用填料经端基封尾的色谱柱。 3.戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱 戴安公司有28种类型的柱子,Acclaim反相柱填料高纯,金属含量极低,*封尾。PH 2-9范围内兼容,低流失,高柱效。尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱,是zui先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱,具极低的硅羟基活性,能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形,与现有的*色谱柱相比有更好的立体选择性。(下图是 Acclaim极性封尾C16柱和市售极性封尾*色谱柱分离酸性化合物谱图的比较) 二、液相色谱柱的使用 色谱柱在使用前,进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是*条件),只有这样,测得的结果才有可比性。但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。 1、样品的前处理 a、使用流动相溶解样品。 b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不 可逆吸附的杂质。 c、使用0.45—#181;m的过滤膜过滤除去微粒杂质。 2、流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的,因此要求流动相具备以下的特点: a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 b、流动相与样品不产生化学反应 c、流动相的黏度要尽量小,以便得到好的分离效果;降低柱压降,延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。 d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器,使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 e、流动相沸点不要太低,否则容易产生气泡,导致实验无法进行。 f、在流动相配制好后,一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测,还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。 3、流动相流速的选择 因柱效是柱中流动相线性流速的函数,使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱,要追求*柱效,使用*流速。对内径为4.6mm的色谱柱,流速一般选择1ml/min,对于内径为4.0mm柱,流速0.8ml/min为佳。 当选用*流速时,分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时,可适当增加甲醇或乙腈的含量)。 注意: a.含水流动相在实验前配制,尤其是夏天使用缓冲 溶液作为流动相不要过夜。加入叠氮化钠,防止细菌生长。 b.流动相要求使用0.45 —#181;m滤膜过滤,除去微粒杂质。 c.使用HPLC级溶剂配制流动相,使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命,提高柱性能。 三. 色谱柱的维护 1. 色谱柱的平衡 反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。 每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱,您就会在处理问题方面获得zui大的"补偿",而且您的色谱柱的寿命也会变得更长!操作步骤: a. 平衡开始时将流速缓慢地提高,用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂流速如果较低,则需要较长的时间来平衡) b. 如果使用的流动相中含有缓冲盐,应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡; 分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。 2. 色谱柱的再生 长期使用的色谱柱,往往柱效会下降(柱子的理论塔板数减低)。可以对色谱柱进行再生,在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。  建议用来冲洗柱子的溶剂体积 色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积 125-4mm 1.6ml 30ml 250-4 mm 3.2ml 60ml 250-10mm 20ml 400ml 选择再生方法: 极性固定相(如Si,NH2* ,DIOL基色谱填料)的再生: 正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水** 非极性固定相(如反相色谱填料RP-18,RP-8,CN等)的再生: 水→乙腈→氯仿(或异丙醇)→乙腈→水 注意: a. 在对NH2改性的色谱柱进行再生时,由于NH2可能以铵根离子的形式存在,因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗,然后再用水冲洗至碱溶液*流出。 b. 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱,如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够*洗去硅胶表面吸附的杂质,在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。 3. 色谱柱的维护 a.使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度) b.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围 c.避免流动相组成及极性的剧烈变化 d.流动相使用前必须经脱气和过滤处理 e.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕柱子冲洗干净,并保存于甲醇或乙腈中 f.氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。

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